1 Microarrays para el análisis de expresión¶
Existen diferentes tipos de microarrays, aunque todos ellos consisten en un soporte físico donde están localizadas biomoléculas conocidas a escala microscópica. Las reacciones y los sistemas de detección utilizados varían de un tipo a otro y muchas veces están basados en técnicas convencionales.
Existen diferentes tipos según la biomolécula: ADN, ARN, proteínas, químicos, anticuerpos, tejidos ....
Si nos centramos en los microarrays de ADN los podemos clasificar según su uso:
- Expresión: Cuantificar un conjunto de mRNAs de una muestra.
- ChIP (Inmuno precipitación de cromatina): Identificar sitios de unión de proteínas.
- Análisis de SNPs: Análisis de marcadores genéticos a gran escala.
- Tilling arrays: Localización de secuencias en el genoma.
- CGH (comparative genome hibridization): Localización de reordenaciones cromosómicas.
- Secuenciación: Identificación de la secuencia nucleotídica
Microarrays de análisis de expresión¶
La base tecnológica es muy similar a la utilizada en los dotplots, pero en este caso lo que esta fijado en el soporte sólido son las sondas y lo que hibridamos son las muestras problema, es decir las sondas no están marcadas y están fijadas en el microarray y la muestra está marcada y la hibridamos sobre las sondas.
Los microarrays de expresión los podemos clasificar según el tamaño de la molécula empleada:
- Oligonucleótidos cortos (<20 bases)
- Oligonucleótidos largos (>30 bases)
- Fragmentos de ADN
Las moléculas están ordenadas en bloques y hay miles de copias de cada sonda. Existen diferentes tipos de imprimir el array, mediante impresión mecánica, de inyección o mediante fotolitografía. En este último los oligonucleótidos se sintetizan directamente en el microarray.
Existen diferentes tipos de sondas:
- Sondas de cDNA: Los cDNAs se imprimen en el microchip. El mayor problema es su estandarización e hibridaciones cruzadas.
- Oligos largos (40-100 nt): Han desbancado a las sondas de cDNA. Mejor en estandarización y disminuyen las hibridaciones cruzadas.
- Oligos cortos (<40 nt): El más usado es el formato Affymetrix tiene sondas PM y MM que se diferencian en un nucleótido.
Para poder estimar correctamente el nivel de expresión de un gen es necesario utilizar diferentes sondas que cubran la extensión del transcrito analizado. El número de sondas depende del formato utilizado pero puede variar desde 3 o 4 sondas a más de 10 por gen. Con el uso continuado del microarray se pueden ir detectando aquellas sondas que no funcionen correctamente y seleccionar aquellas que den mejores resultados para mejorar las siguientes versiones del microarray.
El microarray está organizado en bloques y dentro de cada bloque las sondas están organizadas en filas y columnas. Las diferentes sondas pertenecientes al mismo gen están repartidas por diferentes bloques para evitar sesgos y se sitúan diferentes controles en los bloques (de marcaje, ribosómicos, negativos, duplicados, de contaminación bacteriana, etc). Cada posición de la sonda es conocida y esta indicada en el fichero del mapa del array, estos ficheros son necesarios para el posterior análisis.
Los arrays se pueden comprar prediseñados o diseñarlos con los genes y sondas que queramos. Los microarrays deben ir acompañados de ficheros que nos indiquen la posición y naturaleza de las sondas. Además se acompaña también de un fichero de anotación funcional del gen.
A modo de ejemplo se muestra parte del fichero del mapa del microarray de tomate de Affymetrix y la anotación de éste.